محیط کشت باکتری چیست؟

محیط کشت باکتری باید به گونه‌ای تهیه شود که قبل از تلقیح با یک باکتری خاص، استریل باشد تا تنها نوع باکتری موجود در نمونه باشد. محیط کشت باید هر آنچه باکتری برای تکثیر نیاز دارد را فراهم کند، بنابراین دما، اسیدیته، نوع بستر، مواد غذایی و اکسیژن اهمیت دارند. تعداد محیط موجود برای رشد باکتری قابل توجه است. برخی از محیط‌های کشت عمومی از رشد طیف وسیعی از ارگانیسم ها پشتیبانی می‌کنند. یک نمونه برجسته از یک محیط همه منظوره، آبگوشت سویا آزمایشگاهی (TSB) است.

. یک نوع ماده غنی شده شامل فاکتورهای رشد، ویتامین‌ها و سایر مواد مغذی ضروری برای رشد ارگانیسم‌های سریع‌الرشد است، ارگانیسم‌هایی که نمی‌توانند مواد مغذی خاصی ایجاد کنند و نیاز به افزودن آن‌ها به محیط دارند.

وقتی ترکیب شیمیایی کامل یک محیط شناخته شود، آن را یک محیط شیمیایی تعریف شده می‌نامند. به عنوان مثال در محیط EZ، تمام اجزای شیمیایی منفرد شناسایی شده و مقدار دقیق هر یک از آن‌ها مشخص است. در محیط‌های پیچیده که حاوی عصاره و هضم مخمرها، گوشت یا گیاه هستند، ترکیب شیمیایی دقیق محیط شناخته شده نیست. مقدار اجزای منفرد تعیین نشده و متغیر است. آبگوشت مغذی، آبگوشت سویای آزمایشگاهی و تزریق قلب مغز، همگی نمونه‌هایی از محیط پیچیده هستند.

انواع محیط کشت باکتری:

1-محیط کشت فنیل آلانین د آمیناز (agar Phenylalanine deaminase) یا PD

با استفاده از این محیط می توان قدرت باکتری را در تولید فنیل پیروویک اسید از اسید آمینه فنیل آلانین را تعیین کرد. پس از یک شب انکوباسیون محیط چند قطره محلول ۱۰ درصد کلرور آهن را روی قسمت کشت شده محیط (سطح شیبدار محیط) ریخته، در صورتی که واکنش دی آمیناسیون صورت گرفته باشد. با افزودن معرف، رنگ سبز ظاهر خواهد شد. این رنگ سبز نتیجه شلاته Chlate شدن فنیل پیرووات با یون آهن ایجاد یک ترکیب به رنگ سبز می باشد. در صورت پیدایش رنگ سبز تیره PDمثبت ودر بدون تغییر (زرد رنگ) PD منفی است.

2-محیط کشت سیمون سیترات آگار  (Simmons Citrate )

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربندار موجود در محیط میباشد. باکتری هایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است استفاده کنند و در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند. در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط آزمایش سیترات منفی است.

3- سه قندی آهن دار( agar TCI (Triple Sugar iron

از این محیط جهت تعیین هویت باکتری های گرم منفی استفاده می شود. همچنین برای تعیین تولیدH2S بکار می رود. این محیط دارای سه قند گلوکز، سوکروز و لاکتوز می باشد.

مقدار کمتر گلوکز در قیاس با دو قند دیگر تمایز باکتری ها را در تخمیر قندهای مختلف ممکن می سازد.

بیشتر بخوانید: در مورد GHS بیشتر بدانید

آهن موجود در محیط گاز هیدروژن سولفوره ای را که از مواد گوگرد دار تولید می شود را به دام انداخته و مانع از خروج این گاز از محیط می شود. این واکنش به صورت رنگ سیاه که همان سولفور آهن است مشخص می گردد.

گازی که در نتیجه تخمیر مواد قندی حاصل می شود به صورت حبابهایی در عمق محیط دیده می شوند و یا اینکه حجم گاز ممکن است زیاد بوده که در این صورت محیط آگار را به سمت بالای لوله رانده و فضای زیادی را اشغال می سازد.

4-ژلاتین  (Gelatin medium)

این محیط به منظور تعیین فعالیت پروتئولیتیکی باکتری ها می باشد. باکتری های پروتئولیتیک همیشه باکتری ها را ذوب می کنند. در صورتی که کشت ژلاتین در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده شود، باید قبل از قرائت لوله های حاوی کشت ژلاتین را در دمای یخچال ۴ درجه به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده، در صورتی که باکتری آنزیم ژلاتیناز را داشته باشد، لوله های کشت ژلاتین پس از انکوباسیون در یخچال به صورت مایع خواهند بود. در غیر اینصورت باکتری فاقد آنزیم ژلاتیناز می باشد.

5-محیط کشت Oxidative Fermentative) OF)

با کشت باکتری در این محیط می توان مشخص نمود که استفاده باکتری از کربوهیدرات از طریق اکسیداسیون یا از طریق تخمیر صورت کرفته است. این محیط را در دو قسمت، یکی حاوی پارافین و دیگری فاقد پارافین تهیه نموده و از نمونه در هر دو محیط کشت می دهیم. در صورتی که باکتری تنها از طریق اکسیداسیون قند را مورد استفاده قرار دهد، تنها در لوله فاقد پارافین، قند را مصرف کرده و محیط را اسیدی نموده، که در مجاورت معرف بروموتیمول بلو به رنگ زرد در می آید.

رنگ زرد از بالای لوله شروع می شودکه باکتری از طریق فرمنتاتیو قندها را تخمیر نماید، هر دو لوله کشت (حاوی پارافین و فاقد پارافین) بر اثر تولید اسید شاهد ظهور رنگ زرد خواهیم بود. از محیط OF می توان در تمایز کوکسی های گرم مثبت بخصوص استافیلوکوک اورئوس استفاده نمود.

6-محیط کشت ائوزین متیلن بلو ( agarEosin methylen-blue lactose sucros ) EMB

این محیط فاقد املاح صفراوی می باشد و بیشتر برای باکتری های گرم منفی روده ای مناسب می باشد. باکتری Ecoli در این محیط در حضور ائوزین متیلن بلو ایجاد جلای سبز فلزی می نماید، که کلید تشخیصی باکتری Ecoli نسبت به سایر باکتری های روده ای می باشد.

7-محیط کشت Cookeedmeet

این محیط کشت به دلیل داشتن پارافین، باعث رشد باکتری های بی هوازی می گردد. این محیط کشت محیطی مغذی و غنی برای باکتری های بی هوازی مانند کلستریدیوم است. این محیط معرف خاصی نداشته و هدف ایجاد محیط کشت مناسب برای باکتری های بی هوازی است. بعد از رشد باکتری برای تفریق باید بر روی محیط های افتراقی با شرایط بی هوازی جهت تشخیص باکتری مورد نظر پرداخت.

8-محیط کشت آگار خوندار (  Blood agar)

محیط کشت عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتری های بیماریزا بخصوص باکتری هایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود. بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتری ها را نیز می توان کاوش کرد.پس از اتوکلاو محیط پایه، هنگامی که درجه آن تا حدود ۵۰ درجه سانتیگراد رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت ۵ تا ۷ درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیت های استریل می ریزیم.

بیشتر بخوانید: از تست الایزا برای تشخیص چه مواردی استفاده می شود؟

ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد:

• ۱- همولیز کامل β: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده و اطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد می گردد.
• ۲- همولیز ناقص α: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از ۵۰ درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.
• ۳- عدم همولیزγ : باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد.

9-آگار شکلاته (Chocolate agar)

اگر به محیط پایه آگار خوندار، هنگامی که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو در حدود ۸۰-۷۰ درجه سانتیگراد باشد، خون دفیبرینه گاو اضافه کنیم، محیط کشت آگار شکلاته بدست می آید.

در این محیط بعلت اینکه گلبولهای قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته، برای رشد باکتری هایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می باشد.

همانند محیط کشت آگار خوندار، بسته به نوع باکتری همولیز و یا همولیز ناقص و عدم همولیز ایجاد می گردد.

10- بریلیانت گرین آگار ( Briliant green agar )

محیطی است انتخابی و برای جداسازی گونه های سالمونلا بکار می رود. این محیط از رشد بسیاری از باکتری های روده ای (انتروباکتریاسه) به جز سالمونلا جلوگیری می نماید. در صورتی که Ecoli، کلبسیلا و پروتئوس و سایر انترو باکتریاسه ها رشد نمایند، به دلیل اینکه قند لاکتوز و یا سوکروز و یا هر دو را تخمیر می نمایند و تولید اسید می کنند، در مجاورت معرف رنگی فنل رد به رنگ زرد در می آیند.

در صورتی که باکتری های لاکتوز منفی مانند سالمونلا رشد نمایند، به دلیل عدم تخمیر قند در مجاورت معرف، محیط به رنگ ارغوانی در می آید.

11- مک کانکی آگار  ( Macconkey)

محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتری های گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتری های گرم مثبت می شوند. باکتری های تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبت ها) کلنی هایی به رنگ ارغوانی و باکتری هایی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفی ها) کلنیهایی بی رنگ ایجاد می نمایند.رنگ ارغوانی کلنی های باکتری های لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است.

12- سابور دکستروز آگار (  Saborad Dextrose )

محیط انتخابی برای تکثیر قارچها می باشد که بسیاری از باکتری ها نیز در این محیط رشد می کنند. انتخابی بودن این محیط برای قارچها بر اساس PH پایین و همچنین مواد غذایی ناچیز آن است.

13- DNASE

باکتری هایی که حاوی آنزیم دی اکسی ریبو نوکلئاز باشند، هاله صورتی رنگی اطراف کلنی ها پدید می آورند. تولوئیدن آبی در حضور DNA سالم به رنگ آبی است. ولی در صورت ریختن HCL نرمال موجب تخریب مولکول DNA شده و این ترکیب به رنگ صورتی در می آید.

14- مولر هینتون آگار  (  Mueller hinton )

کاربرد اصلی این محیط جهت تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری ها (آنتی بیوگرام) به روش دیسک می باشد. بسیاری از باکتری هایی که سخت رشد Fastisious می باشند، نظیرNeisseria meningitidesN.gonorrhoeae در آن رشد می یابند.

15- فلچر (Flecher’s medium)

این محیط برای جداسازی و نگهداری لپتوسپیراها بکار می رود. پس از استریلیزه کردن و خنک نمودن محیط، به آن ۸۰ میلی لیتر سرم خرگوش استریل اضافه نموده، سپس به مقدار ۷-۵ میلی لیتر در لوله های استریل ریخته به مدت ۳۰ دقیقه در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد قرار می دهیم تا عامل مکمل موجود در سرم غیر فعال گردد.

برای جداسازی لپتوسپیرا، نمونه های خون-ادرار و نسج مشکوک را در این محیط کشت داده و در حرارت ۲۹ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ روز انکوبه می نماییم. متناوبا از کشت گسترش تهیه کرده و بوسیله میکروسکوپ با زمینه تاریک کشت را کنترل می نماییم.

در اثر تکثیر لپتوسپراها کدورت جزئی در محیط به وجود می آورند که پیدایش یک حلقه شیری رنگ در قسمت بالای محیط می تواند حاکی از رشد لپتوسپرا باشد.

16-محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth) MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم ها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود.

نکته: باید توجه داشت که نتایج کشت حداکثر طی ۲۴ ساعت پس از کشت قرائت گردد. چه بسا پس از این مدت ممکن است واکنش های اسیدی قسمت شیبدار تغییر یافته و قلیایی گردد. قسمتی از این تغییر واکنش اسیدی به قلیایی مربوط به این است که ذخیره کربوهیدرات های موجود در محیط تماما مصرف شده که در این صورت باکتری به مواد پپتون دار محیط رو می آورد و همچنین مقدار ناچیز اسیدی که در اثر تخمیر گلوکز حاصل شده به سرعت در مجاورت هوا (قسمت شیبدار) اکسید شده و ما حصل قلیایی است. در عمق لوله نیز به سبب فشار کم اکسیژن واکنش اسیدی حاصل از تخمیر قند گلوکز و همچنان اسیدی باقی می ماند.

سخن پایانی:

از محیط‌های تخصصی در شناسایی باکتری‌ها استفاده می‌شود و با رنگ‌ها، شاخص‌های pH یا آنتی‌بیوتیک‌ها تکمیل می‌شود .به محیط کشت‌هایی که از رشد میکروارگانیسم‌های ناخواسته جلوگیری کرده و با تأمین مواد مغذی و کاهش رقابت از رشد ارگانیسم مورد علاقه حمایت می‌کنند، محیط کشت انتخابی گفته می‌شود.

نمونه‌ای از یک محیط انتخابی مک‌مانکی آگار است. این ماده حاوی نمک‌های صفراوی و بنفشه کریستالی است که در رشد بسیاری از باکتری‌های گرم مثبت تداخل ایجاد کرده و رشد باکتری‌های گرم منفی، به ویژه انتروباکتریاسه را ترجیح می‌دهد. این گونه‌ها معمولاً روده‌ای نامیده می‌شوند، در روده زندگی می‌کنند و با وجود نمک‌های صفراوی سازگار هستند.

فرهنگ‌های غنی‌سازی رشد ترجیحی یک میکروارگانیسم مورد نظر را که نمایانگر کسری از ارگانیسم های موجود در یک تلقیح است، پرورش می‌دهد.