حساسیت سنجی میکروبی

خدمات حساسیت سنجی میکروبی آرکا طب روهام

شرکت آرکا طب روهام (ATR) خدمات حساسیت سنجی میکروبی را به‌صورت یک پانل جامع، دیسک دفیوژن (انتشار دیسک)، تعیین حداقل غلظت مهاری (MIC) و کشندگی (MBC)، تکنیک E-TEST، روش حفر در آگار (Agar well diffusion)، روش بررسی زمان کشتن (Time-kill curve یا Time-kill test)، روش انتشار در پلاک آگار (Agar plug diffusion) و روش خط متقاطع (Cross streak) را جهت پاسخگویی به نیازهای تحقیقاتی مختلف ارائه می‌دهد.

 

در سال‌های اخیر دانشمندان علاقه زیادی در تحقیق، جستجو و توسعه عوامل ضد میکروبی جدید از منابع مختلف برای مبارزه علیه مقاومت میکروبی از خود نشان داده‌اند، بنابراین توجه زیادی نسبت به غربالگری فعالیت ضد میکروبی و روش‌های ارزیابی معطوف شده است. تعدادی از این سنجش‌های زیستی مثل انتشار دیسک، انتشار در چاهک و رقت در آگار یا محیط مایع به‌خوبی شناخته‌شده و به‌طورمعمول مورداستفاده قرار می‌گیرند. این روش‌ها بسته به موارد استفاده دارای اهمیت و ویژگی‌های خاص می‌باشند که به آن‌ها اشاره می‌کنیم.

 

 

مطالعه کنید >>> بررسی آپوپتوز با استفاده از کیت Annexin

 

---

 

آزمایشگاه آرکا طب روهام آماده ارائه خدمات در این زمینه می باشد:

?تعیین حساسیت ضدمیکروبی به روش دیسک دفیوژن با روش Bauer-Kirby Test Disk Diffusion

?تعیین حساسیت ضدمیکروبی با روش‌های رقیق‌سازی

?تعیین حداقل غلظت مهاری (MIC)

?آگار دایلوشن

?تعیین حداقل غلظت کشندگی (MBC)

?تعیین حساسیت ضدمیکروبی با روش (Epsilometer test (E-test

?روش انتشار در پلاک آگار (Agar plug diffusion)

?روش بررسی زمان کشتن (Time-kill curve یا Time-kill test)

?روش خط متقاطع (Cross streak)

 

ما در شرکت ATR از مواد اولیه برندهای مطرح و معتبر جهانی استفاده می‌کنیم و سعی داریم در کمترین زمان و هزینه ممکن خدمات مربوط به تست‌های حساسیت میکروبی را جهت پاسخگویی به نیازهای تحقیقاتی مختلف شما ارائه می‌دهد. 

 

 

---

 

  چرا شرکت ATRMED را انتخاب کنیم؟

 

کیفیت: ما متعهد به ارائه خدمات با بالاترین کیفیت و تکرارپذیری نتایج ارائه شده هستیم

 

 

---

 

زمان تحویل نتایج: به‌ طور معمول کمتر از ۱۵ روز (بسته به تعداد و نوع نمونه‌ها)

 

 

---

 

قیمت‌گذاری: با تکیه بر دانش تخصصی تیم فنی شرکت ATR، کمترین و رقابتی‌ترین قیمت را ارائه می دهیم

 

 

---

 

خدمات جامع پروژه: ما می‌توانیم با ارائه طیف وسیعی از خدمات مولکولی ازجمله طراحی پرایمر/پروب، الکتروفورز ژل افقی، تعیین توالی پاسخگو کل نیازهای تحقیقاتی شما باشیم

 

---

 

 

ارتباط نزدیک با مشتریان: برای اطمینان از بهینه‌سازی طرح تحقیقاتی‌، به‌صورت مستمر ارتباط را با مشتری حفظ میکنیم و نتایج را با شما در میان گذاشته و تفسیر می‌کنیم

 

 

---

 

برای اطلاع از تعرفه ها با ما تماس بگیرید:

? ایمیل: info@atrmed.com

☎️ تلفن: ۶۶۳۶۱۵۴۳-۰۲۱ و ۶۶۳۷۹۰۲۶-۰۲۱

? موبایل: 09120549892

 

 

---

 

?در مقاله زیر توضیح هر یک از روش های ذکر شده که توسط شرکت ATR انجام می شود؛ آورده شده است:?

---

 

تعیین حساسیت ضدمیکروبی به روش دیسک دفیوژن با روش Bauer-Kirby Test Disk Diffusion

 

محیط کشت مورداستفاده در این تست Mueller- Hinton Agar می‌باشد. برای انجام تست، ابتدا به تعداد نمونه‌های موردنظر، در داخل لوله‌های آزمایش استریل سرم فیزیولوژی استریل ریخته سپس در مجاور شعله مقدار مناسب از کلونی‌های باکتریایی را در سرم فیزیولوژی و در داخل لولهٔ مربوط به آن‌ها تلقیح می‌کنیم. محتویات لوله را ورتکس می‌کنیم تا سوسپانسیون یکنواختی به دست آید. دانسیتهٔ سوسپانسیون‌های باکتریایی جهت انجام تست باید ۱۰^۸ واحد کلنی ساز به ازای هر میلی‌لیتر باشد (CFU 10⁸)؛ برای تهیهٔ سوسپانسیون‌های مذکور، از محلول‌های استاندارد ۵/۰ درصد سولفات باریم (تحت عنوان محلول‌های نیم مک فارلند) استفاده می‌شود.

کدورت سوسپانسیون‌های باکتریایی تهیه‌شده، به‌صورت چشمی با کدورت محلول نیم مک فارلند مقایسه می‌شود (برای مقایسهٔ دقیق‌تر بهتر است از یک صفحه کاغذ سفید که درروی آن خطه‌ای سیاه کشیده شده است، به‌عنوان پس‌زمینه استفاده شود). سوسپانسیون‌های میکروبی تهیه‌شده را، در محیط‌های مولر- هینتون آگار به‌صورت سطحی کشت می‌دهیم، به این صورت که ابتدا سوسپانسیون باکتریایی را ورتکس کرده، سپس باکتری را به‌وسیلهٔ سوآپ آغشته به سوسپانسیون، در محیط‌های مولر کشت می‌دهیم. تمام سطح محیط باید به سوسپانسیون باکتری آغشته شود. دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی را به فواصل ۲-۳ سانتیمتر در بلیت‌های کشت باکتریایی قرار داده و سپس در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۸-۲۴ ساعت انکوبه می نمائیم.

 

مطالعه کنید >>> نگه‌داری و پاساژ رده‌های سلولی

 

 

بعد از اتمام انکوباسیون، حداقل قطر ناحیهٔ عدم رشد در اطراف هر یک از دیسک‌های آنتی‌بیوتیک اندازه‌گیری می‌شوند (برحسب میلی‌متر). سپس با توجه به دستورالعمل (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI مقاومت و حساسیت نسبت به هریک از آنتی‌بیوتیک‌ها موردبررسی قرار میگیرد.

 

 

---

 

تعیین حساسیت ضدمیکروبی با روش‌های رقیق‌سازی

 

این روش‌ها یکی از مناسب‌ترین تکنیک‌ها برای تعیین مقدار حداقل غلظت مهاری (MIC) هستند چراکه توانایی تعیین غلظت عامل ضد میکروبی آزمایش‌شده را دارا می‌باشند. روش‌های رقیق‌سازی دارای تنوع می‌باشد ازجمله آگار دایلوشن، ماکرو دایلوشن و میکرودایلوشن ولی بیشترین مورداستفاده میکرو دایلوشن است چراکه از مواد کمتری در مسیر کار استفاده می‌شود. البته انتخاب روش‌ها بستگی به هدف از انجام آزمایش دارد و استفاده از یک روش خاص دلیل بر بهتر بودن آن روش نسبت به بقیه نیست. این روش‌ها مستلزم استفاده از چند رقت می‌باشند که البته باید ابتدا بریک پوینت آنتی‌بیوتیک خاص برای باکتری موردنظر را از CLSI پیداکرده و غلظت‌ها بر اساس آن تعیین می‌شوند.

 

در شرایطی که از یک عصاره یا اسانس گیاهی استفاده می‌کنیم از غلظت خاصی برای شروع کار استفاده می‌شود. درروش میکرو دایلوشن از لوله استفاده می‌شود که باید به حجم ۲ میلی‌لیتر تهیه شود ولی در روش ماکرو دایلوشن از پلیت های ۹۶ خانه میکروتیتراسیون که حجم کمتری دارند استفاده می‌شود. در این روش‌ها تلقیح باکتری بر اساس نیم مک فارلند صورت می‌گیرد و بعد از گرم‌خانه گذاری MIC کمترین غلظت عامل ضد میکروبی است که به‌طور کامل مانع از رشد ارگانیسم در لوله یا چاهک که توسط چشم غیرمسلح تشخیص داده می‌شود تعیین می‌گردد. معایب ماکرو دایلوشن نداشتن کتابچه راهنما کاربر، ریسک خطا در آماده ساری روش‌های ضد میکروبی برای هر آزمایش و مقدار نسبتاً زیادی مواد مورداستفاده است.

---

آگار دایلوشن در حساسیت سنجی میکروبی

 

این روش شامل ترکیب غلظت‌های مختلف از عامل ضد میکروبی موردنظر در یک محیط کشت آگار می‌باشد که معمولاً به‌صورت دو برابر رقت آگار پس تلقیح یک معرف میکروبی بر روی سطح آگار تلقیح می‌گردد. نقطه پایانی MIC به‌عنوان کمترین غلظت عامل ضد میکروبی در نظر گرفته می‌شود در این روش رعایت اصولی ازجمله اضافه کردن آنتی‌بیوتیک در دمای خاص، رعایت کامل نیم مک فارلند مهم می‌باشد.

آگار دایلوشن اغلب به‌عنوان یک روش استاندارد برای ارگانیسم اسید فست، بی هوازی‌ها و گونه‌های هلیکوباکتر که سخت رشد هستند توصیه می‌شود. این روش برای ترکیبات دارویی ضد قارچی علیه گونه‌های کاندیدا، آسپرژیلوس، فوزوباتریوم و درماتوفیت ها استفاده‌شده است. آگار دایلوشن دارای ارتباط همبستگی قوی با تست E-test برای آزمایش مواد ضد باکتریایی علیه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی می‌باشد.

---

 

روش تعیین حداقل غلظت کشندگی (MBC)

 

پس از تعیین غلظت MIC در روش‌های میکرو دایلوشن و ماکرو دایلوشن می‌توانیم به غلظتی برسیم که باعث مرگ ۹/۹۹ درصد باکتری‌ها می‌شود. برای این منظور از تکنیک MBC استفاده می‌کنیم. در این روش طبق دستورالعمل CLSI از غلظتی که MIC تعیین‌شده است به سمت غلظت بیشتر تا یک الی دو لوله یا چاهک بر روی محیط کشت آگار کشت داده می‌شود و گرمخانه گذاری می‌شود. محیطی که با استفاده از محاسبات توانایی از بین بردن ۹/۹۹ درصد باکتری را داشته باشد به‌عنوان MBC در نظر گرفته می‌شود.

تعیین حداقل غلظت کشندگی (MBC)

---

تعیین حساسیت ضدمیکروبی با روش (Epsilometer test (E-test

این روش ترکیبی در حساسیت سنجی میکروبی از روش اصلی رقیق‌سازی و روش تغلیظ به‌منظور اندازه MIC بوده که با ایجاد یک غلظت گرادیانی از عامل ضد میکروبی آزمایش‌شده در محیط آگار همراه می‌باشد. در این روش یک نوار آغشته به غلظت گرادیانی با عامل ضد میکروبی از یک انتها به قسمت دیگر بر روی سطح آگار بخش می‌شود که قبلاً با میکروارگانیسم موردنظر مورد تلقیح قرارگرفته است. این روش در تعیین MIC آنتی‌بیوتیک‌ها، آنتی قارچ‌ها استفاده می‌شود. مطالعات قبلی همبستگی خوب را بین مقادیر MIC تعیین‌شده توسط E-test و روش‌های دایلوشن نشان می‌دهد.

ثابت‌شده است که روش E-test یک روش دقیق برای تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیکی ارگانیسم‌های سخت رشد ازجمله هلیکوباکتر پیلوری است. این روش برای تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیکی هلیکوباکتر پیلوری توصیه‌شده که نتایج MIC قابل‌مقایسه‌ای را با روش Agar dilution در اختیار قرار می‌دهد. از مزایای E-test می‌توان به‌دقت، سرعت و ساده بودن پروسه آن اشاره نمود. از معایب مهم روش E-test مقرون‌به‌صرفه نبودن این تست می‌باشد که استفاده از آن را با محدودیت همراه کرده است.

---

تعیین حساسیت ضدمیکروبی به روش حفر در آگار (Agar well diffusion)

 

روش حفر در آگار (Agar well diffusion) به‌طور گسترده به‌منظور برسی فعالیت ضد میکروبی عصاره‌های گیاهی استفاده می‌شود. در این روش مانند روش دیسک دفیوژن، سوسپانسیون میکروبی را در سطح پلیت اگار طوری پخش می‌کنیم که به‌طور یکنواخت تمام سطح پلیت را بپوشاند سپس یک سوراخ با قطر ۶ تا ۸ سانتیمتر در شرایط استریل با پانچ ایجاد و یک مقدار مشخص از ماده مجهول جهت سنجش فعالیت ضد میکروبی در چاهک ایجادشده اضافه و بعد از انکوباسیون میزان حاله ایجادشده بررسی می‌شود. از مزایای روش حفر در آگار (Agar well diffusion) می‌توان به سهولت انجام و ارزان و به‌صرفه بودنان اشاره کرد

---

روش انتشار در پلاک آگار حساسیت سنجی میکروبی (Agar plug diffusion)

روش انتشار در پلاک آگار (Agar plug diffusion) اغلب برای تشخیص رابطه آنتاگوانیسم بین میکروارگانیسم‌های مورداستفاده و روش کار مانند دیسک دفیوژن می‌باشد. اساس این روش برساختن یک محیط آگار استوار است که روی محیط کشت رگه‌های نازکی در سطح پلیت مشخص باشد. سلول‌های میکروبی در طول رشد خود مولکول‌هایی را در محیط کشت ترشح می‌کنند. پس از انکوباسیون در شرایط استریل در محیط آگار برشی ایجاد کرده و از سطح آگار برداشته و در سطح دیگر که میکروارگانیسم‌های مورد آزمایش حضور دارد قرار داده می‌شود. مواد پخش‌شده از محیط plug را به محیط منتقل می‌شود و سپس فعالیت ضد میکروبی مولکول‌های ترشح‌شده از مواد ضد میکروبی با استفاده از شناسایی هاله مهار رشد که در اطراف agar plug تشکیل می‌شود قابل‌تشخیص است.

 

---

 

روش بررسی زمان کشتن در حساسیت سنجی میکروبی (Time-kill curve یا Time-kill test)

 

 

روش بررسی زمان کشتن (Time-kill curve یا Time-kill test) یکی از بهترین روش‌ها برای تعیین خاصیت باکتری کشی می‌باشد. این روش از قوی‌ترین ابزارها برای به دست آوردن ارتباط دینامیک بین مواد ضد باکتری‌ها می‌باشد که وابسته به زمان یا وابسته به غلظت است. برای باکتری‌ها این روش به‌خوبی در اسناد M26-A توسط CLSI استانداردسازی و شرح داده‌شده است و در یک محیط مغذی با استفاده از ۳ لوله حاوی سوسپانسیون باکتری به میزان ۱۰^۵×۵ CFU/Ml انجام می‌گیرد. در لوله اول و دوم عصاره یا ماده مورد آزمایش با غلظت نهایی ۲۵/۰ MIC×و ۱ MIC×می‌باشد و لوله سوم به‌عنوان کنترل رشد در نظر گرفته می‌شود. تلقیح در شرایط زمانی مشخص می‌شود و درصد سلول‌های زنده و مرده را محاسبه می‌شود. همچنین از روش بررسی زمان کشتن (Time-kill curve یا Time-kill test) برای بررسی سینرژیسم یا آنتاگوانیسم بین دو یا چند ماده نیز استفاده می‌شود.

---

روش خط متقاطع (Cross streak)

روش خط متقاطع روش غربالگری سریع میکروارگانیسم‌ها ازلحاظ رابطهٔ آنتگوانیسمی می‌باشد. سویه میکروبی توسط یک خط واحد در مرکز آگار کشت داده می‌شود پس از یک دوره انکوباسیون بر اساس سویه میکروبی، با میکروارگانیسم مورد آزمایش به‌صورت یک خط منفرد عمود بر خط مرکزی محیط کشت تلقیح می‌گردد. پس از انکوباسیون بعدی برهم‌کنش‌های ضدمیکروبی با مشاهده اندازه هاله عدم رشد مورد تفسیر قرار می‌گیرد.