الایزا مستقیم بهتر است یا غیر مستقیم؟

الایزا یک روش بیوشیمیایی تحلیلی است که برای اولین بار توسط Engvall و Perlmann در سال 1972 شرح داده شد. این تست به عنوان یک ابزار تشخیصی در پزشکی، آسیب شناسی گیاهان، بیوتکنولوژی و همچنین به عنوان کنترل کیفیت در صنایع مختلف مورد استفاده قرار گرفته است. الایزا روشی است که در آن می توان آنتی بادی ها، پپتیدها، پروتئین ها و مولکول های کوچک را با استفاده از یک صفحه چند چاهکی شناسایی و اندازه گیری کرد و در واقع روشی برتر برای تعیین تیتر آنتی بادی ها می باشد. همچنین از الایزا می توان برای ارزیابی کمی یک آنتی ژن در یک نمونه، که اغلب در قالب کیت ها راحت و با کاربرد آسان در دسترس هستند، با موفقیت به کار رود.

اصول تست الایزا

آزمون ELISA معمولا در بستری از Plateهای ۹۶ خانه از جنس پلی‌استایرن انجام می‌شود. سرم‌ها در چاهک‌هایPlate انکوبه (Incubation) شده و هر چاهک (Well) حاوی سرم متفاوتی است. یک سرم به عنوان کنترل مثبت و یک سرم تحت عنوان کنترل منفی در آزمون الایزا تعیین می‌شوند. روی سطح  Plate  در هر چاهک آنتی ‌بادی به آنتی ‌ژن مورد نظر متصل می‌شود، آنتی بادی‌ها یا آنتی ‌ژن‌های موجود در سرم به آنتی ژن یا آنتی بادی مشابه موجود روی سطح اتصال می‌یابند. بعد از مدتی، این Plate برای حذف آنتی ‌بادی‌ها یا آنتی ‌ژن‌های اتصال‌نیافته با یک سری بافر شستشو، شسته می‌شود.

 برای شناسایی آنتی ‌بادی‌ها یا آنتی ژن‌های متصل شده، آنتی ‌بادی‌های ثانویه‌ای که به یک آنزیم متصل هستند یا به عبارتی دیگر توسط یک آنزیم نشان دار شده‌اند، مانند پراکسیداز یا آلکالین فسفاتاز به هر چاهک اضافه می‌شوند. پس از یک دوره انکوباسیون، آنتی ‌بادی‌های ثانویه که متصل نشده‌اند، با شستشو از بین می‌روند. هنگامی‌ که یک سوبسترا(Substrate) مناسب به محیط اضافه می‌شود، آنزیم با آن واکنش می‌دهد تا یک محصول رنگی و قابل ردیابی تولید کند. این رنگ تولید شده به عنوان یک تابع از مقدار آنتی ‌ژن یا آنتی ‌بادی موجود در نمونه قابل اندازه‌گیری است. شدت تراکم رنگی / نوری در طول موجی مشخص اندازه‌گیری می‌شود. شدت رنگ، نشان دهنده میزان آنتی ژن یا آنتی بادی است.

آزمون الایزا می‌تواند کاملاً پیچیده باشد و از چندین مرحله اضافه کردن آنتی‌ بادی‌ها و آنزیم‌ها در آن استفاده شود، به ویژه هنگام اندازه‌گیری غلظت پروتئین در نمونه‌‌های ناهمگن مانند خون مراحل مختلفی برای انجام آزمون الایزا مورد انجام قرار می‌گیرد. پیچیده‌ترین و متفاوت‌ترین مرحله در روند کلی آزمون، مرحله تشخیص است که در آن می‌توان از چندین لایه آنتی بادی برای تقویت سیگنال استفاده کرد.

بیشتر بخوانید : معرفی سمپلر و انواع آن

انواع تست

الایزا را می‌توان با تعدادی تغییر در اصول روش اصلی انجام داد، این تغییرات منجر به ایجاد ۴ روش مختلف از آزمون الایزا می‌شوند، این روش‌ها شامل موارد زیر هستند:

• الایزا به روش مستقیم
• الایزا به روش غیرمستقیم
• الایزا ساندویچ
• الایزا رقابتی یا مهاری

بررسی تست الایزا مستقیم

در این نمونه آنتی ژن یا آنتی بادی موجود در نمونه ی که باید تشخیص داده شود به طور مستقیم بر سطح فاز جامد کوت میشود و سپس آنتی بادی یا آنتی ژن مکمل ان که نشاندار شده است به سیستم اضافه میشود در صورت وجود آنتی ژن یا آنتی بادی مورد نظر در نمونه سیگنال مناسب ایجاد میشود این روش مشابه ایمنوفلورسانس مستقیم است اما کاربرد چندانی در کیت های تشخیصی ندارد و بیشتر در کارهای تحقیقاتی استفاده میشود.

مزایا:

• سریع است زیرا فقط یک آنتی بادی استفاده می شود و مراحل کمتری دارد.
• مشکل واکنش متقاطع آنتی بادی ثانویه حذف می شود.

معایب:

• قدرت واکنشگری ایمنی آنتی بادی اولیه ممکن است تحت تاثیر لیبل شدن با آنزیم قرار بگیرد.
• لیبل کردن آنتی بادی های اولیه برای هر واکنش اختصاصی الیزا وقت گیر و پر هزینه است.
• عدم انعطاف پذیری در انتخاب لیبل آنتی بادی اولیه از آزمایش به آزمایش دیگر.
• سیگنال به اندازه کافی تقویت نمی شود.

بیشتر بخوانید : تست الایزا چیست؟

بررسی تست الایزا غیر مستقیم

این روش برای تعیین آنتی بادی اختصاصی و یا تیتراسیون آنتی بادی در نمونه های سرم مورد استفاده قرار میگیرد.اساس ازمایش بدین نحو است که معمولا سرم رقیق شده به آنتی ژن های کوت شده در فاز جامد (میکروول یا چاهک) اضافه میشود. آنتی ژن کوت شده آنتی ژن اختصاصی مربوط به آنتی بادی است که قرار است در نمونه ردیابی شود،پس از افزودن نمونه وطی زمان انکوباسیون ویک مرحله شستشو آنتی هیومن گلوبین نشاندار شده با آنزیم به چاهک اضافه میشود بر حسب اینکه چه کلاسی از آنتی بادی برای ردیابی اهمیت دارد نوع آنتی هیومن مورد استفاده نیز متفاوت است.مثلا برای ردیابی آنتی بادی کلاس IgG از آنتی هیومن IgG و برای ردیابی کلاس IgA از آنتی هیومن IgA استفاده میشود.

  مزایا:

• طیف گسترده ای از آنتی بادی های ثانویه دارای لیبل به صورت تجاری در دسترس هستند.
• چند منظوره است زیرا بسیاری از آنتی بادی های اولیه را می توان در یک گونه تهیه کرد و از همان آنتی بادی ثانویه که لیبل دارد برای تشخیص استفاده کرد.
• قدرت اتصال به آنتی ژن آنتی بادی اولیه حفظ می شود زیرا برچسب گذاری نشده است.
• حساسیت افزایش می یابد زیرا هر آنتی بادی اولیه شامل چندین اپی توپ است که آنتی بادی ثانویه دارای برچسب می تواند به آن متصل شود و تقویت سیگنال را امکان پذیر می سازد.

معایب:

• واکنش متقابل ممکن است با آنتی بادی ثانویه رخ دهد و منجر به سیگنال غیر اختصاصی شود.
• یک مرحله انکوباسیون اضافی در این روش لازم است.

نتیجه‌گیری

روش‌های مختلف تست الایزا کاربردهای متفاوتی نیز دارند و نمی‌توان با قطعیت درمورد برتری هر کدام از آنها نظر داد، ولی با توجه به علائم و بررسی مورد نظر از روش‌های متفاوت آن استفاده می‌کنیم.

درصورت تمایل به خرید مواد آزمایشگاهی، محصولات سیگما آلدریچ، محصولات مرک آلمان و … میتوانید به فروشگاه آثل طب سربزنید.