پی سی آر PCR

خدمات پی سی آر (PCR) آرکا طب روهام

آزمایشگاه آرکا طب روهام، انواع مختلفی از خدمات بر پایه پی سی آر PCR در راستای پاسخگویی به نیاز پروژه تحقیقاتی شما و همچنین خدمات بهینه‌سازی واکنش‌های پی سی آر  را در جهت تسهیل پروژه تحقیقاتی شما ارائه می‌دهد. شرکت ATR-MED به‌واسطه کارشناسان خبره خود توانسته است هزینه خدمات بهینه‌سازی واکنش‌های پی سی آر PCR را کاهش داده تا به شما در دستیابی به نتایج بهتر و صرفه‌جویی در زمان و هزینه کمک کند. 

برخی از برنامه‌های کاربردی بر پایه تکنولوژی پی سی آر PCR عبارت‌اند از:

♦ توالی یابی DNA (مثل پروژه ژنوم انسان)

♦ اثرانگشت DNA

♦ پزشکی قانونی

♦ تشخیص باکتری یا ویروس‌ها (به‌خصوص ایدز) و

♦ تشخیص بیماری‌های ارثی

در این تکنیک به علت توانایی سنتز DNA از مقدار کم و رسیدن به تعداد کپی بالا از DNA، PCR یک‌راه بسیار کارآمد برای سنتز DNA است و گاهی اوقات به‌عنوان “Molecular Photocopying” از آن یاد می‌شود.

مشخصات دستگاه ترموسایکلر Eppendorf آزمایشگاه آرکا طب روهام: 

? دارای المنت Peltier برای تغییر سریع دما: ° 3 سانتیگراد در هر ثانیه

?دارای Heated Lid سازگار با انواع تیوب برای جلوگیری از چگالش

?قابلیت ذخیره اطلاعات و اتصال به پرینتر و کامپیوتر

?ترموبلاک یونیورسال: سازگار با پلیت میکروتیتر 5×5، میکروتیوب ml 0/2، میکروتیوب ml 0/5 و…

PCR چگونه عمل می‌کند؟

PCR عمدتاً بر اساس مجموعه‌ای از ۲۰-۴۰ چرخه مکرر حرارت و سرما است تا تکثیر DNA را با واکنش آنزیمی تسهیل کند. میزان توالی هدف با هر چرخه دو برابر می‌شود که منجر به سنتز نمایی الگو هدف (^{تعداد چرخه‌ها ۲}) می‌شود؛ بنابراین، در PCR با چرخه ۴۰ تکرار، ۱،۹۹،۵۱۱،۶۲۷،۷۷۶ نسخه از DNA از یک نسخه از الگو تولید خواهد شد.

 انواع الگوهای DNA و استراتژی مواجه با آن

نوع DNA الگو مورداستفاده برای امپلیفیکاسیون یک منطقه هدف می‌تواند کارایی و دقت PCR را تحت تأثیر قرار دهد. در زیر سه نوع از الگوهای رایج PCR همراه با استراتژی‌های بهبود نتایج PCR معرفی می‌شود.

♦ الگو غنی از GC

محتوای GC به درصد بازه‌ای‌های گوانین و سیتوزین منطقه‌ای از DNA اشاره دارد. الگو غنی از GC (محتوای بالاتر از ۶۰% GC) باعث افزایش استحکام پیوند هیدروژنی می‌شود؛ زیرا سه پیوند هیدروژنی بین جفت باز GC در مقایسه با جفت باز AT ایجاد می‌شود. محتوای GC بالا منجر به افزایش احتمال ایجاد ساختار ثانویه می‌شود، به علت اینکه ساختار ثانویه درزمانی تشکیل می‌شود که مناطق مکمل در یک تک رشته DNA وجود داشته باشد در این حالت تک رشته در جایگاه خود به‌صورت لوپ برمی‌گردد و پیوند هیدروژنی بین بازها تشکیل می‌شود.

هر دو افزایش استحکام پیوند هیدروژنی و ساختارهای ثانویه مانع مرحله دناتوراسیون و اتصال پرایمرها در PCR می‌شود. ساختارهای ثانویه نیز ممکن است منجر به خاتمه زودرس واکنش به‌عنوان یک نتیجه از توقف و به دام افتادن پلیمراز شود.

اتصال پرایمرها به جایگاه‌هایی با توالی تکراری در رشته الگو، اغلب در قالب‌های غنی از GC اتفاق می‌افتد در این صورت پرایمرها برای اتصال رقابت کرده و شاهد تشکیل آمپلیکون اشتباه هستیم. مناطق پروموتور اکثر ژن‌های خانه‌دار، ژن‌های اختصاصی بافت و ژن‌های سرکوبگر تومور غنی از محتوای GC هستند که امپلیفیکاسیون این الگوها را مشکل کرده است.

استراتژی‌هایی که برای بهبود امپلیفیکاسیون قالب‌های محتوای بالا GC استفاده می‌شود شامل بهینه‌سازی شرایط ترموسایکلر و استفاده از افزودنی‌ها می‌باشد.

دمای انیلینگ بالا می‌تواند به جلوگیری از اتصال‌های غیراختصاصی پرایمرها کمک کند. طول مدت‌زمان انیلینگ باید به‌اندازه کافی بلند باشد تا اجازه دهد پرایمرها به‌طور صحیح به جایگاه خود اتصال یابند اما به‌اندازه کافی نیز کوتاه باشد تا از اتصال رقابتی جلوگیری شود.

افزودنی‌هایی مانند DMSO و بتائین می‌توانند به‌عنوان ناپایدار کننده‌های ساختار ثانویه عمل کنند، بنابراین دمای ذوب و مدت‌زمان دناتوراسیون را کاهش می‌دهد و اتصال اختصاصی پرایمرها افزایش می‌یابد.

 ♦ الگوهای غنی از AT

الگوهای غنی از AT اغلب نیاز به دمای اتصال پایین دارند زیرا پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازها به‌اندازه الگوهای غنی از GC قوی نیستند. از سوی دیگر، اتصال پرایمرها به‌صورت غیراختصاصی در زیر دمای اتصال می‌تواند، ایجاد شود.

استفاده از مواد افزودنی مانند TMAC می‌تواند Tm را افزایش دهد، بنابراین اختصاصیت پرایمرها افزایش می‌یابد. غلظت TMAC افزوده‌شده باید بهینه شود زیرا امپیلیفیکاسیون آنزیم در غلظت‌های بالای این افزودنی می‌تواند مهار شود.

دمای اکستنشن پایین‌تر از ۶۵-۶۸ درجه سانتی‌گراد الگوهای غنی از AT اغلب نیز به امپیلیفیکاسیون کمک می‌کند، زیرا ذوب شدن DNA در دمای اکستنشن معمول ۷۲ درجه سانتی‌گراد مانع گسترش موفقیت‌آمیز مناطق غنی از AT می‌شود.

 ♦ الگوهای طولانی

حفظ عملکرد بالا، اختصاصت و دقت در PCR و امپیلیفیکاسیون الگوهای طولانی اغلب دشوار است. الگوهای طولانی معمولاً احتمال بیشتری از شکستن، دگر ده یا تکه‌تکه شدن در هنگام تهیه نمونه یا Depurination دارند. Depurination به یک واکنش شیمیایی اشاره دارد که طی آن پیوند β-N-glycosidic در نوکلئوزیدهای پورین به‌عنوان‌مثال A و(G به‌منظور آزاد شدن باز، برش داده‌شده و هیدرولیز می‌شود.

ازآنجاکه DNA پلیمراز در طی تکثیر در جایگاه بدون پورین نمی‌تواند عمل کند، Depurination عامل مهمی در ایجاد محدودیت در امپیلیفیکاسیون الگوها طولانی است. پلیمراز گاهی اوقات نوکلئونید های غلط را در انتهای ’۳ در طی تکثیر قرار می‌دهد که ممکن است باعث خاتمه زودرس و تجمع محصولات کوتاه شده شود؛ بنابراین، بازده امپیلیفیکاسیون به دلیل افزایش محصولات کوتاه شده کاهش می‌یابد. برای جلوگیری از این موارد می‌توان چندین استراتژی را استفاده کرد:

?استفاده از pH بالاتر: PH پایین باعث Depurination الگوها می‌شود. بدین ترتیب افزایش pH واکنش پی سی آر  باعث محافظت الگو از Depurination می‌شود، بنابراین تعداد محصولات کوتاه شده کاهش‌یافته و عملکرد افزایش می‌یابد.

? اضافه کردن گلیسرول یا DMSO: کارایی پردازش DNA پلیمراز هنگام کار با الگوهای طولانی مهم است. DMSO و گلیسرول، دو مواد افزودنی هستند که باعث بی‌ثباتی DNA و تغییر ویژگی‌های ذوب DNA دو رشته‌ای می‌شوند و بدین این ترتیب، دماهای دناتوراسیون و اتصال کاهش می‌یابد.

? کاهش زمان دناتوراسیون: زمانی که زمان دناتوراسیون طولانی باشد، در اتصال پرایمرها تداخل ایجادشده و Depurination الگوها رخ می‌دهد. کیفیت الگو برای اطمینان از کیفیت امپیلیکون بسیار مهم است و می‌تواند با کاهش زمان دناتوراسیون، افزایش یابد.

? افزایش زمان مرحله گسترش: افزایش زمان مرحله گسترش باعث می‌شود تا زمان کافی برای تکثیر توسط DNA پلیمراز با افزودن نوکلئونید ها به وجود آید. این کار باعث کاهش تعداد محصولات کوتاه شده و درنتیجه افزایش عملکرد محصولات PCR طولانی‌تر می‌شود.

? استفاده از یک DNA پلیمراز با خاصیت ویرایش: یک DNA پلیمراز ثانویه ترمواستیبل که حاوی خاصیت ’۳ به ’۵ اگزونوکلئازی یا “Proofreading” است، می‌تواند نوکلئوتیدهای غلط جفت شده را حذف کند که به‌طور قابل‌توجهی توانایی DNA پلیمراز را برای سنتز محصولات بلند با عملکرد بالاتر فراهم می‌کند.

 انتخاب سرویس PCR شرکت ATR-MED

 نکات گفته‌شده تنها بخشی از تکنیک‌هایی است که ممکن است هر فردی با این مشکلات، روبرو شود و بسته به نوع نمونه، انتخاب آنزیم و افزودنی‌ها، اهمیت و ارزش پیدا می‌کند. تیم متخصصین شرکت ATR-MED با تکیه‌بر تجربه و دانش خود در زمینه واکنش‌های مختلف پی سی آر PCR خدمات متنوعی را ارائه می‌دهد. ما با استفاده از دستگاه‌های پیشرفته و افراد آموزش‌دیده در زمینه علم مولکولی، نتایجی با بالاترین کیفیت و مطابق با استانداردهای روز در کمترین زمان و کمترین هزینه به شما ارائه خواهیم داد.

 طراحی و انجام انواع پی سی آر PCR که توسط تیم متخصصین آزمایشگاه آرکا طب روهام قابل انجام است:

• ? Nested –seminested PCR ?
•   ? Touchdown PCR ?
• ? Multiplex PCR ?
• ? Inverse PCR ?
• ? Hot start PCR ?
• ? Allele specific PCR ?
• ? Asymmetric PCR ?
• ? Arbitrary PCR ?
• ? Colony PCR ?
• ? Core sample PCR ?
• ? Degenerate PCR ?
• ? Assembly PCR ?
• ? Dial-out PCR ?
• ? Digital PCR ?
• ? Traditional PCR ?
• ? Inter sequence PCR ?
• ? Ligation-mediated PCR ?
• ? Methylation- specific PCR ?
• ? Conventional PCR ?
• ? In-silico PCR ?
• ? Suicide PCR ?
• ?  …و Standard PCR ?

چرا شرکت ATR را انتخاب کنیم؟

شرکت ATR-MED با در نظر گرفتن تمامی موارد، انجام PCR نمونهٔ شما مشتری گرامی را با بالاترین کیفیت، تضمین می‌کند. ما با بهره‌گیری از بهترین مواد اولیه و افراد باتجربه خود در زمینه PCR، آماده ارائه این سرویس با کمترین هزینه و زمان هستیم.