طراحی پرایمر و پروب

خدمات طراحی پرایمر و پروب آرکا طب روهام

با بهره‌مندی از خدمات شرکت آرکا طب روهام (ATR)، در زمینه طراحی پرایمر و پروب کیفیت، موفقیت و نتیجه بهتر آزمایش خود را تضمین کنید. شرکت ATR در تمامی مراحل طراحی  درکنار شما خواهد بود. ما با استفاده از نرم‌افزارهای به‌روز و تکنولوژی پیشرفته و همچنین استفاده از افراد باتجربه صحت پرایمر یا پروب طراحی شدهٔ شما را تضمین می‌کنیم.

تیم متخصص شرکت ATR با استفاده از پایگاه ها و نرم افزارهای زیر آنالیز و طراحی پرایمر و پروب را انجام می دهد:

?Sequence Massager

?Vector NTI

?Oligo

?Allele ID

?NCBI

?primer3plus

عوامل مهم در طراحی پرایمر:

?دمای ذوب: دمای ذوب (Tm) یک پرایمر، دمایی است که در آن نیمی از سایت‌های اتصال پرایمر اشغال‌شده است. دمای ذوب با طول پرایمر افزایش می‌یابد. دمای ذوبی که بیش‌ازحد زیاد است، به‌عنوان‌مثال بیش از ۸۰ درجه سانتی‌گراد، توصیه نمی‌شود. محاسبه دمای ذوب برای هر دو پرایمر استفاده‌شده در واکنش نباید بیش از ۵ درجه سانتی‌گراد اختلاف داشته باشد و دمای ذوب محصول سنتز شده نباید بیش از ۱۰ درجه سانتی‌گراد با پرایمرهای مورداستفاده، متفاوت باشد. دمای اتصال باید ۵ درجه سانتی‌گراد پایین‌تر از دمای ذوب محاسبه‌شده باشد. بااین‌حال دمای ذوب باید بر اساس شرایط هر آزمایش انتخاب شود.

?طول: پرایمرهایی که بیش‌ازحد کوتاه هستند، به‌طور غیراختصاصی به نقاط مختلف یک الگو DNA اتصال می‌یابند که در پی آن شاهد سنتز کپی‌های غیراختصاصی DNA خواهیم بود. طول پرایمر بسته به دمای ذوب متغیر است. طول مطلوب یک پرایمر به‌طورکلی بین بیست و چهل نوکلئوتید و دمای ذوب آن بین ۶۰ تا ۷۵ درجه سانتی‌گراد است.
?محتوای GC: محتوای GC باید بین ۶۰-۴۰ درصد باشد.
ساختارهای دوم: از ساختار سنجاق سری بیش از ۴ عدد و دیمر بیش از ۸ عدد باید اجتناب شود. انتهای ‘۳ بسیار حساس است و نباید مکمل یک منطقه از پرایمر دیگر استفاده‌شده در واکنش باشد و توالی مورداستفاده باید دارای بازهای صحیح و منطبق با الگوی واکنش باشد.

موارد ذکر شده تنها تعدادی از عوامل مهم در طراحی پرایمر و پروب می باشد. تیم متخصص شرکت ATR با تکیه بر دانش، مهارت و تخصص خود تمامی فاکتورهای مهم را در هنگام طراحی پرایمر و پروب نظرگرفته و پرایمر و پروب طراحی شده را تضمین میکند.

 

چرا شرکت ATR را انتخاب کنیم؟

کیفیت: ما متعهد به ارائه خدمات با بالاترین کیفیت و تکرارپذیری نتایج ارائه شده هستیم

زمان تحویل نتایج: به‌ طور معمول کمتر از 4-3 روز (بسته به تعداد و نوع نمونه‌ها)

قیمت‌گذاری: با تکیه بر دانش تخصصی تیم فنی شرکت ATR، کمترین و رقابتی‌ترین قیمت را ارائه می دهیم

خدمات جامع پروژه: ما می‌توانیم با ارائه طیف وسیعی از خدمات مولکولی ازجمله طراحی پرایمر/پروب، الکتروفورز ژل افقی، تعیین توالی پاسخگو کل نیازهای تحقیقاتی شما باشیم

ارتباط نزدیک با مشتریان: برای اطمینان از بهینه‌سازی طرح تحقیقاتی‌، به‌صورت مستمر ارتباط را با مشتری حفظ میکنیم و نتایج را با شما در میان گذاشته و تفسیر می‌کنیم

برای اطلاع از تعرفه ها با ما تماس بگیرید:

? ایمیل: info@atrmed.com

☎️ تلفن: ۶۶۳۶۱۵۴۳-۰۲۱ و ۶۶۳۷۹۰۲۶-۰۲۱

? موبایل: 09120549892

 

?در ادامه انواع پروب های مورداستفاده در Real-time PCR را مشاهده میفرمایید?

♦ پروب FRET یک اولیگونوکلئوتید تک رشته‌ای لیبل شده با فلورسنت است که دارای حساسیت بالایی بوده و قادر به شناسایی توالی اختصاصی است.

♦ FRET Probes

 

♦ Molecular beacons پروب هایی بسیار حساس در واکنش می‌باشند که برای شناسایی توالی خاص در Real-time PCR کاربرد دارند و برای شناسایی پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی نیز مناسب می‌باشند.

 

♦ Molecular beacons

 

♦ Twice-dyed probes)TDP’s) نسخه‌ای از پروب ها هستند که دارای دورنگ بوده و حساسیت فوق‌العاده بالایی دارند. پروب های دورنگ که به‌عنوان پروب های هیدرولیز شونده، نیز شناخته می‌شوند، شایع‌ترین نوع پروب های qPCR هستند. کوئنچر از انتشار فلورسانس طبیعی ریپورتر جلوگیری می‌کند و بک‌گراند واکنش در این نوع پروب بسیار پایین است. پروب های دورنگ باقدرت انتخاب در انواع مختلفی از رنگ‌های ریپورتر فلورسنت و کوئنچر برای انواع سیستم‌عامل‌های Real-time PCR، بسته به نیاز مشتریان عزیز است.

 

♦ Twice Dyed Probes

 

تمام پروب هایی که دارای دورنگ هستند ماکسیمم ۴۰ نوکلئوتید طول داشته، (‘۵ تغییریافته و ‘۳ دارای کوئنچر) و با HPLC خالص می‌شوند.

? مزیت رنگ‌ها و کوئنچر های مختلف:

جایگزینی مؤثر برای پروب های MGB

جایگزین رقابتی قیمت رنگ‌های VIC، NED و PET

♦ Scorpions probes پرایمر های اسکورپیون پروب هایی با حساسیت فوق‌العاده بالا بوده که ساختاری سنجاق سری دارد و این پروب یک پرایمر اختصاصی برای واکنش PCR و پروبی برای توالی DNA به‌طور هم‌زمان است. هم‌زمانی این دو مکانیسم، موجب بالا رفتن سرعت کینتیک واکنش شده که منجر به تولید سریع سیگنال فلورسنت Real-time PCR بدون ایجاد واکنش‌های جانبی رقابتی می‌شود.پرایمر های اسکورپیون نیازی به تجزیه آنزیمی در سیکل PCR ندارند. ویژگی‌های منحصربه‌فرد اسکورپیون، امکان طراحی پروبی قابل‌اعتماد را با سیگنال‌های قوی‌تر، زمان واکنش کوتاه‌تر و قدرت تمایز بهتر نسبت به دیگر سیستم‌های دو مولکولی فراهم می‌کند. پروب اسکورپیون ابزاری ارزشمند برای تشخیص SNP، endpoint PCR و Real-time PCR و تعیین مقدار کمی ژن را ارائه می‌دهد.

♦ Scorpions probes

 

 

اگر برای طراحی پروب qPCR به کمک نیاز دارید یا در انتخاب ترکیب رنگ و کوئنچر برای استفاده در یک ترموسایکلر خاص سردرگمید، با ما تماس بگیرید.ما می‌توانیم طراحی پرایمر یا پروب شمارا نیز بر عهده گیریم و علاوه بر این، با طیف وسیعی از خدمات مولکولی ازجمله الکتروفورز ژل افقی، تعیین توالی، PCR و Real-time PCR، استخراج DND و RNA پاسخگو کل نیازهای تحقیقاتی شما باشیم.

 

?نکات کلیدی آموزشی در طراحی پرایمر و پروب?

طراحی پرایمر مناسب برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR) موفقیت‌آمیز امری ضروری و حیاتی است. در طراحی پرایمر باید به نکات زیر توجه نمود:

1) طول اولیه پرایمر:

طول بهینه پرایمرها برای انجام PCR بین 18 تا 24 جفت باز است تا پرایمرها به‌راحتی به رشته الگ. در دمای انلینگ بچسبند.

2) دما ذوب اولیه (Tm):

دمایی است که در آن نیمی از دوپلکس DNA برای تبدیل‌شدن به تک رشته جدا می‌شود و نشان‌دهنده استحکام در رشته‌های DNA است. پرایمرها با دمای ذوب در محدوده 50-60 درجه سانتی‌گراد عموماً بهترین نتایج را نشان می‌دهند. آغازگرهای با دمای ذوب بالاتر از 65 درجه سانتی‌گراد تمایل به ساختار ثانویه دارند و معمولاً باعث اتصالات غیراختصاصی می‌گردد.

3) درجه حرارت اولیه:

درجه حرارت ذوب اولیه یک برآورد پایداری ترکیبی DNA است و میزان دمایی است که دران دو رشته DNA از همدیگر جدا می‌شوند پس اگر بیش‌ازحد بالا باشد عمل هیبریداسیون پرایمر به‌صورت نامناسب انجام می‌گیرد و منجر به تولید محصول PCR می‌شود که از کیفیت خوبی برخوردار نیست و منجر به تولید محصولات غیر خاصی می‌شود که ناشی از تعداد زیاد ناسازگاری‌های جفت‌پایه است.

4) محتویات GC:

محتوای GC در پرایمر به‌عنوان یک درصد از کل پایه پرایمر باید بین 40-60% باشد.

5) گیره GC:

حضور پایگاه‌های G و C در انتهای 3 ‘ پرایمر (گیره GC) مانند یک گیره به پرایمر کمک می‌کند تا اتصال قوی‌تری ایجاد کند و بستگی به پیوندهای سه‌گانه اسیدهای نوکلئیک می‌باشد.

6) ساختارهای دوم پرایمر:

ساختارهای ثانویه پرایمر توسط اتصالات بین‌مولکولی یا داخل مولکولی ایجاد می‌شوند و می‌تواند منجر به تضعیف یا عدم عملکرد پرایمر شود. ازجمله ین ساختارها فرم Hairpins است که دران پرایمر به شکل سنجاق‌سر بر روی خود برمی‌گردد و باعث اتصال به خودش شده درنتیجه کارایی ندارد. Self-dimer primer نیز از موارد ساختاری نادرست در پرایمر است که دو پرایمر همولوگ به همدیگر اتصال پیدا می‌کنند. یکی دیگر زا مشکلات رایج اخطار Cross Dimer می‌باشد که به‌طورکلی مقادیر زیادی از پرایمر ها در PCR در مقایسه با مقدار ژن هدف مورداستفاده قرار می‌گیرند در این شرایط باندی در پایین‌ترین قسمت ژل دیده می‌شود. در این شرایط در چند باز که همولوگ هم هستند اتصال صورت می‌گیرد و باعث ایجاد این اشتباه می‌شود.

7) توالی‌های تکرار:

گاهی تکرار دی نوکلئوتید چندین بار به‌صورت متوالی اتفاق می‌افتد و باید از آن اجتناب شود، زیرا ممکن است باعث اتصالات اشتباه و یا مواردی که اشاره شد گردد. به‌عنوان‌مثال در این توالی ATATATAT حداکثر تعداد تکرارهای دی نوکلئوتید در الگو قابل‌قبول 4 بار است ولی تا جایی که شرایط طراحی اجازه می‌دهد باید ازاین‌گونه توالی‌ها جلوگیری کرد. باید از رشته‌های طولانی از یک باز اجتناب شود. به‌عنوان‌مثال، در این توالی AGCGGGGGATGGGG باز G 4 و 5 بار پشت سرم تکرار شده است که حداکثر تعداد قابل‌قبول 4 بار است.

8) اجتناب از ساختار ثانویه الگو:

الگوی تک رشته توالی‌های اسید نوکلئیک بسیار ناپایدار است و به ترکیبات (ساختارهای ثانویه) تقسیم می‌شود. ثبات این سازه‌های ثانویه الگو بستگی زیادی به انرژی آزاد و دمای ذوب آن‌ها (Tm) دارد. توجه به ساختارهای ثانویه الگو در طراحی پرایمرها به‌ویژه در qPCR مهم است. پس برای به دست آوردن نتیجه بهتر باید از قالب‌های پایدار در طراحی استفاده کرد. برای ایجاد قالب پایدار باید ابتدا یک DNA دو رشته ایجاد کرد و از توالی آن برای طراحی استفاده کرد و منظور از قالب پایدار همین است.

9) اجتناب از همولوژی:

برای بهبود خاصیت پرایمرها لازم است از مناطق همخوانی جلوگیری شود. پرایمرهای طراحی‌شده نباید بر ژن‌های غیراختصاصی تأثیر داشته باشد. به‌طورمعمول، پرایمرها طراحی‌شده مورد BLAST قرار می‌گیرند که در صورت پیشنهاد دیتابیس بتوان از یک جایگزین بهتر استفاده کرد.

با توجه به نکات گفته‌شده باید به چند نکته در طراحی پرایمر و پروب دقت کرد:

• طول پرایمر باید 18-24 جفت باز باشد.
• محتوای GC باید در رنج 40 تا 60 درصد باشد.
• دمای ذوب یا TM بین 50-60 درجه سانتی‌گراد باشد.
• بین دو رشته پرایمر دمای Tm باید 5 درجه سانتی‌گراد از یکدیگر تفاوت داشته باشد.
• مناطق مکمل وجود نداشته باشد.

طراحی پرایمر و پروب برای واکنش Real-Time PCR  به‌دقت بیشتری نیاز دارد ولی کلیات در طراحی پرایمر ها چه برای واکنش‌های ساده PCR چه واکنش‌های Real-Time PCR یکسان است.

در طراحی پرایمر و پروب برای واکنش Real-Time PCR علاوه بر نکات قبلی باید به این نکات نیز توجه کرد:

• پرایمر را بر اساس نواحی اگزون در توالی cDNA طراحی شوند

• Tm برای پرایمر 58-60 درجه سانتی‌گراد و برای پروب 10 درجه بیشتر از Tm پرایمر باشد.
• طول پرایمر 15-30 جفت باشد.
• محتویات GC باید 30-80% باشد.
• در توالی پرایمر و پروب داشتن حتی یک نوکلوتید مشابه مشکل‌ساز است.
• ماکسیمم طول توالی بیشتر از 400 جفت باز نباشد. امپلیکون های کوچک‌تر نتایج پایدارتری می‌دهند.

پروب نباید تکرار نوکلوتید یکسان داشته باشد.

طراحی با استفاده از نرم‌افزار

استفاده از نرم افزارها می‌تواند هزینه، زمان و احتمال خطا در طراحی پرایمر را کاهش داد. ولی باید به این نکته دقت کرد که یک نرم‌افزار به‌تنهایی قادر نخواهد بود که تمامی نکات لازم برای طراحی یک پرایمر خوب را ارائه دهد.

شرکت ATR با استفاده از چندین نرم‌افزار قدرتمند کارآیی و کیفیت پرایمر طراحی‌شده را تضمین می‌نماید.

از نرم‌افزار مورداستفاده در طراحی پرایمر و پروب می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:

?Primer Premier نرم‌افزاری است که می‌تواند هم‌زمان فاکتورهای متعددی را مورد برسی قرار دهد.

?Primer3 نیز یک نرم‌افزار آنلاین در طراحی پرایمر است و از دقت بالایی برخوردار است.

?PrimerPlex نرم‌افزاری است که می‌تواند آغازگرها را برای Multiplex PCR و تست‌های ژنوتیپ SNP چندگانه طراحی کند.

?نرم‌افزارهایی مانند AlleleID و Beacon Designer در طراحی پرایمر متقاطع، طرح پرایمر متقابل گونه برای تست‌های تشخیص پیچیده کاربرد دارند

طراحی سنتز پرایمر و پروب در انجام کارهای مولکولی ازاهمیت بالایی برخوردار است و به‌طورکلی یک طراحی خوب و سنتز مناسب نتیجه یک PCR یا qPCR را تغییر خواهد داد. متخصصین شرکت ATR با تکیه‌بر دانش و تجربهٔ خود طراحی پرایمر و پروب های پروژهٔ شمارا بر عهده می‌گیرد تا دیگر نگران عدم موفقیت‌آمیز بودن واکنش مولکولی خود نباشید.

 

برای اطلاع از تعرفه ها با ما تماس بگیرید:

? ایمیل: info@atrmed.com

☎️ تلفن: ۶۶۳۶۱۵۴۳-۰۲۱ و ۶۶۳۷۹۰۲۶-۰۲۱

? موبایل: 09120549892

 

شرکت کیاژن