ثبات یک آنتی بیوتیک به ساختار شیمیایی آن، روش جداسازی (از منابع طبیعی یا سنتز شیمیایی) و مکانیسم های غیرفعال شدن بستگی دارد. آنتی بیوتیک های نسل اول جدا شده از منابع طبیعی، مانند پنی سیلین ، ناپایدارترین و به دنبال آن مشتقات نیمه سنتزی آن (مانند آمپی سیلین و کربوکسی سیلین) هستند. آمینوگلیکوزیدها (کانامیسین، اسپکتینومایسین و غیره) با ثبات تر هستند. بنابراین راه ذخیره و مصرف آنتی بیوتیک ها در آزمایشگاه چیست؟
بیشتر آنتی بیوتیک ها به عنوان پودرهای خشک پایدار هستند. حل کردن پودر در آب استریل یا سایر حلالها (اکثر اوقات اتانول مطلق) ترکیب را در معرض هیدرولیز قرار می دهد و آنتی بیوتیک را بی ثبات تر می کند. به همین دلیل می بایست استوک آنتی بیوتیکی در دمای 20- درجه سانتیگراد و پلیت آگار را در 4 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
برخی مطالعات حاکی از آن است که آنتی بیوتیک های مشتق شده از پنی سیلین و تتراسایکلین ها فقط به مدت 3 ماه (حتی در دمای 20- درجه سانتیگراد) پایدار هستند، اما بیشتر استوک های آنتی بیوتیکی دیگر حداقل 6 ماه می توانند در این درجه حرارت ذخیره شوند.
برای جلوگیری از غیرفعال شدن توسط گرما، توصیه می شود استوک آنتی بیوتیک به آگار خنک شده در حمام آب 55 درجه سانتیگراد، قبل ریختن به پلیت ها اضافه شود. تعدادی از آنتی بیوتیک ها نه تنها به گرما بلکه به نور حساس هستند (جدول زیر را ببینید)، بنابراین اگر پلیت ها را در کلد روم با نور روشن ذخیره می کنید، بهتر است آنها را در فویل بپیچید.
به جز موارد خاص، آنتی بیوتیک ها تا 6 ماه در پلیت ها پایدار هستند. با این حال، تا این زمان، پلیت ها ممکن است خشک شوند، ترک بردارند یا در قطرات آب شناور شوند، بنابراین بهتر است بعد از ریختن پلیت ها، کمتر از 3 ماه از آنها استفاده شود.
بسته به بچ آنتی بیوتیک و بک گراند سویه، حساسیت ممکن است متفاوت باشد، بنابراین قبل از انجام یک آزمایش بزرگ، ایده خوبی است که چگونگی رشد سویه را روی پلیت بررسی کنید.
پنی سیلین و آمپی سیلین کمترین پایداری را در پلیت دارند. پلیت حاوی 100 نانوگرم در میلی لیتر آمپی سیلین را می توان به مدت یک ماه نگه داشت، اما تا پایان ماه؛ غلظت مؤثر نیمی از غلظت اصلی است. این پلیت هنوز هم می توانند برای لیگیشن استفاده شوند (زمان کمیاب شدن کلنی ها ترانسفرم شده برای ایجاد پلاسمید و بیان -β لاکتاماز)، اما نه ترانسفورماسیون پلاسمید (جایی که ریت ترانسفورماسیون زیاد است – شما به کلنی های متجمع و مخلوط خواهید رسید.
| آنتی بیوتیک | حساسیت به نور | حلال | پایداری |
| کلرامفنیکل | – | اتانول | یک ماه |
| مشتقات تتراسایکلین: اکسی تتراسایکلین، کلرو تتراسایکلین، داکسی | + | اتانول | یک ماه |
| مشتقات پنی سلین: کربوکسی سیلین، کاربنی سیلین | – | آب | یک ماه |
| آمینوگلوکوزیدازها: جنتامایسین، نئومایسین، کانامایسین، پارومومایسین، اسپکتینومایسین و استرپتومایسین | – | آب | بیشتر از 6 ماه |
| ماکرولیدها: اریترومایسین، لینکومایسین و اسپیرامایسین | – | آب | بیشتر از 6 ماه |
| سولفونامیدها: سولفودیازین، سولفامرازین، سولفاموکسول، سولفادیمیدین | – | آب | بیشتر از 6 ماه |
| کینولون ها: نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین، انروفلوکساسین، اکسولینیک اسید، نالیدیک اسید | – | NaOH یک نرمال | بیشتر از 6 ماه |
اطلاعات پس زمینه
پلاسمیدها می توانند دارای یک یا چند ژن مقاومت در برابر آنتی بیوتیک باشند، که به باکتری حامل آن پلاسمید مقاومت را القا میکند. وجود یک ژن مقاومت در برابر آنتی بیوتیک در این پلاسمیدها به محققان اجازه می دهد باکتریهای حاوی پلاسمید را از باکتری هایی که بدون پلاسمید هستند، جدا کنند (به عنوان مثال رشد باکتری ها در حضور آنتی بیوتیک).
محیط کشت Luria broth) LB) یک محیط غنی از مواد مغذی است که معمولاً برای کشت باکتریها در آزمایشگاه استفاده می شود. پلیت آگار LB اغلب برای جداسازی کلنی باکتریهای دارای پلاسمید خاص استفاده می شود. با این حال، یک محیط کش تمایع قادر به حمایت از تراکم بالاتر باکتری ها است و برای رشد تعداد کافی باکتری لازم برای جداسازی کافی DNA پلاسمیدی برای استفاده های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می گیرد.
فیلم زیر را مشاهده کنید تا یاد بگیرید چگونه باکتری را در کشت مایع تلقیح کنید.
4 گرم NaCl
4 گرم تریپتون
2 گرم عصاره مخمر
و dH2O تا 400 میلی لیتر
توجه: اگر آزمایشگاه شما دارای پودر آگار LB از قبل مخلوط شده است، به جای موارد بالا، از مقدار پیشنهادی استفاده کنید.
در بطری را طور شل ببندید ( اگر محکم ببندید بطری ممکن است منفجر شود!) سپس تمام قسمت بالای بطری را با فویل آلومینیومی بپوشانید. اتوکلاو کنید و بگذارید تا دمای اتاق خنک شود. حالا درب بطری را پیچ کرده و LB را در دمای اتاق ذخیره کنید.
2. هنگامی که آماده تلقیح باکتری به محیط کشت خود هستید، LB مایع را به یک لوله یا فلاسک اضافه کرده و آنتی بیوتیک مناسب را به غلظت صحیح اضافه کنید (جدول زیر را ببینید).
| Commonly Used Antibiotics | Recommended Concentration |
|---|---|
| Ampicillin | 100 µg/mL |
| Bleocin | 5 µg/mL |
| Carbenicillin | 100 µg/mL |
| Chloramphenicol | 25 µg/mL |
| Coumermycin | 25 µg/mL |
| Gentamycin | 10 µg/mL |
| Kanamycin | 50 µg/mL |
| Spectinomycin | 50 µg/mL |
| Tetracycline | 10 µg/mL |
توجه: اگر قصد انجام یک Mini-prep را دارید، 2 میلی لیتر محیط در لوله فالکون کفایت میکند، اما برای Large-prep از یک لیتر LB در یک فلاسک 2 لیتری استفاده کنید.
3. با استفاده از نوک پیپت استریل یا خلال دندان، یک پلیت آگار LB انتخاب کنید.
4. نوک پیپت استریل یا خلال دندان را درونمایع LB+ آنتی بیوتیک رها کنید و لوله را تکان دهید.
5. لوله را با فویل آلومینیومی استریل یا کلاهی که از ورود هوا خیلی جلوگیری نکند، بپوشانید.
6. کشت باکتری در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 12-18 ساعت در دستگاه شیکر انکوباتور
توجه: بعضی از پلاسمیدها یا سویه ها در دمای 30 درجه سانتی گراد نیاز به رشد دارند. در این صورت، شما برای به دست آوردن تراکم صحیح باکتری ها نیاز به زمان طولانی تری دارید زیرا آنها در دماهای پایین تر آهسته تر رشد می کنند.
رشد را بررسی کنید که با ایجاد ابر در محیط مشخص می شود (به راست مراجعه کنید).
توجه: برخی از باکتری ها قبل تلقیح نیاز به رسیدن به فاز لگاریتمی ذارند. دستورالعمل های مربوط به پروتکل خاص خود را بررسی کرده و OD600 را انجام دهید تا در صورت لزوم تراکم محیط خود را اندازه گیری کنید.
توجه: كنترل منفي LB+ آنتی بیوتیک و هيچ گونه باكتري تلقيح شده است. شما نباید بعد از انکوباسیون یک شبه رشدی در این محیط مشاهده کنید.
7. (اختیاری) برای ذخیره طولانی مدت باکتری ها، می توانید استوک با گلیسرول تهیه کنید.
8. اکنون می توانید پلاسمید یا DNA خود را از محیط کشت باکتری توسط محصولات جداسازی و استخراج DNA و پلاسمید جدا کنید.
همچنین می توانید در کانال تلگرام ما عضو شوید و از آخرین محصولات، اطلاعات و پیشنهادهای ویژه ما برخوردار باشید.
اینستاگرام موادشیمیایی آزمایشگاهی تحقیقاتی و آنتی بادی ما رو فالو کنید و محصولات و تخفیف های ما مطلع شوید:
برای دریافت مشاوره کاملا تخصصی و دریافت راهنمایی از طریق راه های ارتباطی برای خرید و ثبت سفارش اقدام نمایید:
فروشگاه ATR-MED، با تشکیل تیمی از نخبگان کشور (عضو بنیاد ملی نخبگان و دارای مقالات علمی متعدد ثبت‌شده در مجلات معتبر) که ارتباط نزدیک علمی با مراکز تحقیقاتی و دانشگاهی اروپا و آمریکایی را دارد، فعالیت خود را به‌طور تخصصی در زمینه فروش آنلاین جامع محصولات علوم زیستی و خدمات آزمایشگاهی ارائه می دهد.
تمامی حقوق این وب سایت در اختیار آثل طب راد مد ایرانیان (ATR-MED) بوده و استفاده از محتوای آن تنها با درج منبع امکان پذیر می باشد.
